U području proučavanja proteolitičkih enzima, peptidni supstrati igraju ključnu ulogu. Ove specijalizirane molekule ključni su alati za istraživače koji žele razumjeti složene mehanizme proteolize, uključujući specifičnost enzima, regulaciju aktivnosti i obrasce cijepanja supstrata. Kao vodeći dobavljač peptidnih supstrata, predani smo pružanju visokokvalitetnih proizvoda koji mogu značajno poboljšati vaše istraživanje proteolitičkih enzima. U ovom blogu istražit ćemo detalje o tome kako učinkovito koristiti peptidne supstrate u studijama proteolitičkih enzima.
Razumijevanje peptidnih supstrata
Peptidni supstrati su kratki lanci aminokiselina dizajnirani da oponašaju prirodne supstrate proteolitičkih enzima. Pažljivo su projektirani da sadrže specifične sekvence aminokiselina koje prepoznaju ciljne proteaze. Kada proteolitički enzim naiđe na odgovarajući peptidni supstrat, on će cijepati supstrat na određenom mjestu, što će rezultirati oslobađanjem produkata cijepanja. Taj se događaj cijepanja zatim može detektirati i mjeriti različitim metodama, pružajući vrijedne informacije o aktivnosti i specifičnosti enzima.
Odabir odgovarajućeg peptidnog supstrata
Prvi korak u korištenju peptidnih supstrata u studijama proteolitičkih enzima je odabir pravog supstrata za vaše specifične potrebe istraživanja. Tijekom procesa odabira treba uzeti u obzir mnoge čimbenike.
Specifičnost enzima
Različiti proteolitički enzimi imaju različite specifičnosti supstrata, koje su određene sekvencama aminokiselina koje okružuju mjesto cijepanja. Na primjer, tripsin je serinska proteaza koja cijepa peptidne veze na karboksilnoj strani ostataka lizina ili arginina. Stoga, kada proučavate tripsin, trebali biste odabrati peptidni supstrat koji sadrži lizinski ili argininski ostatak na odgovarajućem mjestu cijepanja. Nudimo širok raspon peptidnih supstrata prilagođenih različitim proteolitičkim enzimima, kao što suZ - LLY - FMK CAS 133410 - 84 - 1, koji je dizajniran za specifične proteolitičke aktivnosti povezane s određenim vrstama proteaza.
Metoda otkrivanja
Metoda detekcije koju planirate koristiti također utječe na odabir supstrata. Postoji nekoliko uobičajenih metoda detekcije, uključujući fluorescenciju, apsorbanciju i radioaktivno označavanje. Fluorescentno obilježeni peptidni supstrati naširoko se koriste jer omogućuju osjetljivo otkrivanje aktivnosti enzima u stvarnom vremenu. Cijepanje fluorescentnog peptidnog supstrata rezultira promjenom intenziteta fluorescencije, što se lako može pratiti pomoću čitača fluorescencije. Na primjer,Suc - IIW - AMCje fluorescentni peptidni supstrat koji se može koristiti za mjerenje aktivnosti određenih proteaza. Kada se supstrat cijepa ciljnim enzimom, AMC dio se oslobađa, a njegova fluorescencija može se detektirati na specifičnoj valnoj duljini.
Eksperimentalni uvjeti
Eksperimentalni uvjeti kao što su pH, temperatura i ionska snaga mogu utjecati na performanse peptidnih supstrata i proteolitičkih enzima. Neki su enzimi aktivni u određenim pH rasponima, a stabilnost peptidnih supstrata također može biti pod utjecajem ovih uvjeta. Stoga morate odabrati supstrat koji je kompatibilan s vašim eksperimentalnim uvjetima. Naš tim za tehničku podršku može pružiti detaljne informacije o optimalnim uvjetima za korištenje naših peptidnih supstrata kako bi se osigurali najbolji eksperimentalni rezultati.
Priprema peptidnih supstrata
Nakon što ste odabrali odgovarajući peptidni supstrat, sljedeći korak je da ga pripremite za upotrebu u vašim eksperimentima. Opći koraci za pripremu podloge su sljedeći:
Otapanje
Većina peptidnih supstrata isporučuje se kao liofilizirani prah. Da biste ih otopili, trebate koristiti odgovarajuće otapalo. Izbor otapala ovisi o svojstvima supstrata i zahtjevima vašeg eksperimenta. Za peptidne supstrate topive u vodi, obično se koriste puferske otopine kao što je fosfatno puferirana fiziološka otopina (PBS) ili Tris-HCl pufer. Za hidrofobne peptidne supstrate mogu biti potrebna organska otapala kao što je dimetil sulfoksid (DMSO). Međutim, važno je napomenuti da visoke koncentracije organskih otapala ponekad mogu inhibirati aktivnost enzima, pa konačnu koncentraciju otapala u reakcijskoj smjesi treba pažljivo kontrolirati.
Određivanje koncentracije
Nakon otapanja potrebno je odrediti koncentraciju otopine peptidnog supstrata. To se može učiniti različitim metodama, kao što je mjerenje apsorbancije na određenoj valnoj duljini. Na primjer, ako vaš peptidni supstrat sadrži kromogenu ili fluorogenu skupinu s poznatim koeficijentom molarne ekstinkcije, možete upotrijebiti Beer-Lambertov zakon za izračunavanje koncentracije supstrata na temelju očitanja apsorbancije.
Provođenje testova proteolitičkih enzima
S pripremljenim peptidnim supstratom sada možete postaviti testove proteolitičkih enzima. Ovdje je opći protokol za tipičnu enzimsku analizu:
Postavljanje reakcije
Pripremite reakcijsku smjesu koja sadrži peptidni supstrat, proteolitički enzim i odgovarajući reakcijski pufer. Pufer bi trebao osigurati optimalni pH i ionsku snagu za aktivnost enzima. Reakcijska smjesa se obično inkubira na određenoj temperaturi određeno vrijeme. Temperatura i vrijeme inkubacije ovise o karakteristikama enzima i ciljevima pokusa. Na primjer, neki enzimi su najaktivniji na 37°C, dok drugi mogu zahtijevati niže ili više temperature.
Praćenje reakcije
Tijekom razdoblja inkubacije možete pratiti napredovanje proteolitičke reakcije. Ako koristite fluorescentni ili kromogeni peptidni supstrat, možete mjeriti promjenu fluorescencije ili apsorbancije u redovitim intervalima pomoću odgovarajućeg instrumenta. Povećanje ili smanjenje signala tijekom vremena odražava enzimatsko cijepanje supstrata.
Analiza podataka
Nakon inkubacije analizirajte podatke dobivene korakom praćenja. Možete izračunati aktivnost enzima na temelju brzine cijepanja supstrata. Aktivnost enzima obično se izražava kao količina supstrata koji se cijepa po jedinici vremena. Ova se vrijednost može koristiti za usporedbu aktivnosti različitih enzima, proučavanje učinaka inhibitora enzima ili istraživanje utjecaja različitih čimbenika na aktivnost enzima. Na primjer, ako testirate inhibitorni učinak spoja na enzim, možete izmjeriti aktivnost enzima u prisutnosti i odsutnosti inhibitora i izračunati postotak inhibicije.
Korištenje peptidnih supstrata za probir inhibitora
Peptidni supstrati su također neprocjenjivi u studijama probira inhibitora. Inhibitori se mogu koristiti za regulaciju aktivnosti enzima, ispitivanje funkcije enzima i razvoj potencijalnih terapijskih sredstava. Za pretragu inhibitora proteolitičkih enzima pomoću peptidnih supstrata, slijedite ove korake:
Pripremite otopine inhibitora
Otopite potencijalne inhibitore u odgovarajućem otapalu u različitim koncentracijama. Otapala bi trebala biti kompatibilna i s inhibitorom i s enzimskim testnim sustavom.
Postavite testove inhibitora
Pripremite reakcijske smjese koje sadrže peptidni supstrat, proteolitički enzim i različite koncentracije inhibitora. Također uključite kontrolnu reakciju bez inhibitora. Inkubirajte reakcijske smjese pod istim uvjetima kao u redovnoj enzimskoj analizi.
Mjerenje inhibicijskih učinaka
Pratite aktivnost enzima u svakoj reakcijskoj smjesi koristeći istu metodu detekcije kao što je gore opisana. Usporedite aktivnosti enzima u prisutnosti i odsutnosti inhibitora kako biste odredili inhibicijski učinak. Možete iscrtati krivulju doza - odgovor kako biste izračunali vrijednost IC50, koja predstavlja koncentraciju inhibitora potrebnu za inhibiciju 50% aktivnosti enzima. Spojevi poputInhibitor kalpaina XI CAS 145731 - 49 - 3može se koristiti u takvim testovima probira inhibitora, a naše sveobuhvatne informacije o proizvodu mogu vam pomoći u planiranju i izvođenju ovih eksperimenata.
Zaključak
Peptidni supstrati nezamjenjivi su alati u proučavanju proteolitičkih enzima. Pažljivim odabirom odgovarajućeg supstrata, njegovom ispravnom pripremom i provođenjem dobro osmišljenih enzimskih testova, istraživači mogu dobiti dragocjene uvide u mehanizme proteolize. Kao dobavljač peptidnih supstrata, posvećeni smo pružanju visokokvalitetnih proizvoda i profesionalne tehničke podrške kako bismo zadovoljili vaše istraživačke potrebe. Bilo da proučavate kinetiku enzima, tražite inhibitore ili istražujete nove terapijske ciljeve, naši peptidni supstrati mogu vam pomoći u postizanju vaših istraživačkih ciljeva.
Ako ste zainteresirani saznati više o našim peptidnim supstratima ili imate bilo kakvih pitanja u vezi s njihovom upotrebom u vašim studijama proteolitičkih enzima, slobodno nas kontaktirajte za detaljne informacije o proizvodu i za početak rasprave o nabavi. Naš iskusni tim spreman je pomoći vam u pronalaženju najprikladnijih proizvoda za vaše specifične istraživačke zahtjeve.
Reference
- Barrett, AJ i Salvesen, GS (Ur.). (1998). Proteolitički enzimi: praktični pristup. Oxford University Press.
- Turk, BE i Craik, CS (2000). Pristupi identifikaciji inhibitora proteaza usmjerenih na aktivno mjesto. Chemical Reviews, 100 (12), 4159 - 4172.
- Rawlings, ND, Barrett, AJ i Finn, RD (2018). MEROPS: baza podataka proteolitičkih enzima, njihovih supstrata i inhibitora 2017. i usporedba s peptidazama u bazi PANTHER. Istraživanje nukleinskih kiselina, 46 (D1), D624 - D632.