Transfekcija je presudna tehnika u molekularnoj biologiji koja omogućava uvođenje stranih nukleinskih kiselina u stanice, omogućavajući istraživačima da proučavaju funkciju gena, ekspresiju proteina i stanične signalne putove. Stanice TET-213, stanična linija ljudskog neuroblastoma, obično se koriste u istraživanjima neuroznanosti zbog njihovih neuronskih svojstava. U ovom postu na blogu podijelit ću neke uvide o tome kako učinkovito transfektirati TET-213 ćelije, crpeći na mom iskustvu kao dobavljač TET-213 stanica.
Razumijevanje TET-213 stanica
Prije nego što uđete u proces transfekcije, važno je razumjeti karakteristike stanica TET-213. Te stanice izvedene su iz ljudskog neuroblastoma i pokazuju značajke neurona kao što je sposobnost proširenja neurita i izražavanja neuronskih markera. To su adhezivne stanice koje dobro rastu u standardnim uvjetima stanične kulture, obično u mediju dopunjenom fetalnom goveđem serumom (FBS) i antibioticima.
Odabir prave metode transfekcije
Na raspolaganju je nekoliko metoda za transfekcijske stanice, a svaka je s vlastitim prednostima i ograničenjima. Izbor metode transfekcije ovisi o različitim čimbenicima, uključujući vrstu nukleinske kiseline koja se transfektira, stanični tip i željena učinkovitost transfekcije. Evo nekoliko uobičajenih metoda transfekcije pogodne za stanice TET-213:
Transfekcija na bazi lipida
Transfekcija na bazi lipida jedna je od najčešće korištenih metoda za uvođenje nukleinskih kiselina u stanice. To uključuje upotrebu reagensa na bazi lipida koji tvore komplekse s nukleinskom kiselinom, koje stanice uzimaju kroz endocitozu. Transfekcija na bazi lipida relativno je lako izvesti i može postići visoku učinkovitost transfekcije u mnogim tipovima stanica, uključujući stanice TET-213.
Elektroporacija
Elektroporacija je fizička metoda koja koristi električno polje za stvaranje privremenih pora u staničnoj membrani, omogućavajući nukleinskoj kiselini da uđu u stanice. Ova je metoda posebno korisna za transfekcijske stanice koje je teško transfektirati pomoću drugih metoda, poput primarnih stanica. Međutim, elektroporacija može biti štetna za stanice i može zahtijevati optimizaciju parametara elektroporacije kako bi se postigla visoka učinkovitost transfekcije.
Virusna transdukcija
Virusna transdukcija uključuje uporabu virusnih vektora za isporuku nukleinske kiseline u stanice. Virusni vektori dobivaju se iz virusa koji su projektirani tako da nose željenu nukleinsku kiselinu i mogu učinkovito inficirati stanice. Virusna transdukcija može postići visoku učinkovitost transfekcije i može se koristiti za transfekciju širokog raspona tipova stanica, uključujući stanice TET-213. Međutim, virusna transdukcija zahtijeva specijaliziranu opremu i stručnost, a postoje potencijalne sigurnosne probleme povezane s uporabom virusnih vektora.
Priprema stanica za transfekciju
Pravilna priprema stanica ključna je za uspješnu transfekciju. Evo nekoliko koraka koje treba slijediti prilikom pripreme TET-213 stanica za transfekciju:
Stanična kultura
Održavajte stanice TET-213 u prikladnom mediju stanične kulture dopunjene FBS-om i antibioticima. Redovito prolazite stanice kako biste održali svoju eksponencijalnu fazu rasta. Važno je koristiti zdrave, aktivno rastuće stanice za transfekciju, jer stanice u lošem fiziološkom stanju mogu imati nižu učinkovitost transfekcije.
Zasijavanje ćelije
Sjeme stanice TET-213 u posudi za kulturu ili ploču s više jažica na odgovarajućoj gustoći. Gustoća sjemenki ovisi o metodi transfekcije i vrsti eksperimenta. Za transfekciju na bazi lipida obično se preporučuje gustoća sjemenki od 50-80% konfluencije.
Inkubacija stanica
Inkubirajte zasijane stanice u vlažnom inkubatoru na 37 ° C s 5% CO2 najmanje 24 sata prije transfekcije kako bi se stanice omogućile pričvršćivanje i oporavak od procesa sjemenki.
Izvođenje transfekcije
Jednom kada se stanice pripreme, vrijeme je za obavljanje transfekcije. Ovdje je opći protokol za transfekciju TET-213 na bazi lipida:
Pripremite transfekcijski reagens
Slijedite upute proizvođača da pripremite transfekcijski reagens na bazi lipida. Obično to uključuje razrjeđivanje reagensa u prikladnom mediju za transfekciju.
Pripremite nukleinsku kiselinu
Pripremite nukleinsku kiselinu na transfektu, poput plazmidne DNK ili siRNA. Razrijedite nukleinsku kiselinu u prikladnom mediju za transfekciju.
Tvori transfekcijski kompleks
Pomiješajte razrijeđeni transfekcijski reagens i razrijeđenu nukleinsku kiselinu u cijevi i inkubirajte na sobnoj temperaturi 15-30 minuta kako biste omogućili stvaranje transfekcijskog kompleksa.
Dodajte transfekcijski kompleks stanicama
Uklonite medij za kulturu iz stanica i zamijenite ga svježim medijem za transfekciju. Dodajte transfekcijski kompleks u stanice padne i nježno okrenite ploču da bi se kompleks ravnomjerno rasporedio.
Inkubirati stanice
Inkubirajte transficirane stanice u vlažnom inkubatoru na 37 ° C s 5% CO2 u odgovarajućoj količini vremena, ovisno o vrsti nukleinske kiseline i eksperimentu. Za transfekciju DNA plazmida, vrijeme inkubacije od 24-48 sati obično je dovoljno da se omogući ekspresija gena.
Procjena učinkovitosti transfekcije
Nakon transfekcije, važno je procijeniti učinkovitost transfekcije kako bi se utvrdilo je li transfekcija bila uspješna. Na raspolaganju je nekoliko metoda za procjenu učinkovitosti transfekcije, uključujući:
Fluorescentna mikroskopija
Ako transficirana nukleinska kiselina kodira fluorescentni protein, poput GFP -a, fluorescentna mikroskopija može se koristiti za vizualizaciju transficiranih stanica. Postotak fluorescentnih stanica može se koristiti kao procjena učinkovitosti transfekcije.
Protočna citometrija
Protočna citometrija može se koristiti za kvantificiranje postotka transficiranih stanica na temelju ekspresije fluorescentnog markera ili antigena stanične površine. Ova metoda pruža precizniju i kvantitativnu mjeru učinkovitosti transfekcije u usporedbi s fluorescentnom mikroskopijom.
Western blotting ili qPCR
Ako transficirana nukleinska kiselina kodira protein od interesa, Western blotting ili qPCR može se koristiti za otkrivanje ekspresije proteina na razini proteina ili mRNA. Ova metoda može pružiti informacije o razini ekspresije gena i funkcionalnosti transficiranog proteina.
Rješavanje problema s uobičajenim problemima transfekcije
Transfekcija ponekad može biti izazovna, a može se dogoditi nekoliko uobičajenih problema. Evo nekoliko savjeta za rješavanje problema za uobičajene probleme s transfekcijom:
Niska učinkovitost transfekcije
- Provjerite kvalitetu i količinu nukleinske kiseline. Provjerite je li nukleinska kiselina čista i visoke kvalitete.
- Optimizirajte uvjeti transfekcije, poput koncentracije reagensa transfekcije, omjera nukleinske kiseline i reagencije i vremena inkubacije.
- Provjerite zdravlje i održivost stanica. Provjerite jesu li stanice zdrave i aktivno rastu prije transfekcije.
- Isprobajte drugu metodu transfekcije ili reagens.
Stanična toksičnost
- Smanjite koncentraciju transfekcijskog reagensa ili nukleinske kiseline.
- Optimizirajte uvjeti transfekcije kako biste umanjili oštećenje stanica.
- Koristite drugačiju metodu transfekcije ili reagens koji je manje toksičan za stanice.
Promjenjiva učinkovitost transfekcije
- Provjerite jesu li stanice ravnomjerno i na odgovarajućoj gustoći.
- Temeljito pomiješajte kompleks transfekcije prije dodavanja stanicama.
- Inkubirajte stanice u dosljednim uvjetima kako biste minimizirali varijabilnost.
Zaključak
Transfekcijske stanice TET-213 mogu biti izazovan, ali nagrađivan proces. Odabirom prave metode transfekcije, pravilno pripremajući stanice i slijedeći odgovarajući protokol, možete postići visoku učinkovitost transfekcije i dobiti pouzdane rezultate. Ako imate bilo kakvih pitanja ili vam je potrebna dodatna pomoć u transfekciji stanica TET-213, ne ustručavajte se kontaktirati nas. Mi smo vodeći dobavljač stanica TET-213 i možemo vam pružiti visokokvalitetne stanice, transfekcijske reagense i tehničku podršku.
Pored stanica TET-213, nudimo i širok raspon peptida, uključujućiGalanan (čovjek),,Ciklo (rgdfc), iDynorphin A (1-13), amid, svinje. Ovi se peptidi mogu koristiti u različitim istraživačkim aplikacijama, poput neuroznanosti, istraživanja raka i otkrivanja lijekova.
Ako ste zainteresirani za kupnju TET-213 ćelija ili bilo kojeg od naših peptida, kontaktirajte nas kako bismo razgovarali o vašim specifičnim potrebama. Radujemo se što ćemo raditi s vama i pomoći vam da postignete svoje istraživačke ciljeve.
Reference
- Sambrook, J., i Russell, DW (2001). Molekularno kloniranje: laboratorijski priručnik. Laboratorij za hladnu proljetnu luku.
- Ausubel, FM, Brent, R., Kingston, RE, Moore, DD, Seidman, JG, Smith, JA, & Struhl, K. (ur.). (2002). Trenutni protokoli u molekularnoj biologiji. John Wiley & Sons.
- Chen, C., i Okayama, H. (1987). Transformacija visoke učinkovitosti stanica sisavaca plazmidom DNA. Molekularna i stanična biologija, 7 (8), 2745-2752.
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., & Hofschneider, PH (1982). Prijenos gena u mišje stanice lima elektroporacijom u visokim električnim poljima. EMBO Journal, 1 (7), 841-845.
- Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, FH, ... & Verma, IM (1996). In vivo isporuka gena i stabilna transdukcija nedivizivnih stanica lentivirusnim vektorom. Science, 272 (5259), 263-267.