U području istraživanja i razvoja peptida, čistoća kataloških peptida od najveće je važnosti. Kao posvećeni dobavljač peptida kataloga, razumijemo značaj pružanja proizvoda visoke kvalitete našim kupcima. Ponekad, unatoč najboljim naporima u početnim postupcima sinteze i pročišćavanja, može postojati potreba za daljnjem pročišćavanjem kataloških peptida. U ovom ćemo blogu istražiti razne metode i razmatranja za daljnje pročišćavanje peptida kataloga kada je to potrebno.
Zašto daljnje pročišćavanje?
Nekoliko je razloga zbog kojih bi moglo biti potrebno daljnje pročišćavanje kataloških peptida. Prvo, u vrlo osjetljivim istraživačkim aplikacijama kao što su testovi na bazi stanica, in vivo studije ili strukturna biološka istraživanja, čak i količina nečistoća u tragovima može imati značajan utjecaj na eksperimentalne rezultate. Nečistoće bi potencijalno mogle ometati biološku aktivnost peptida, što dovodi do lažnih pozitivnih ili negativa.
Drugo, regulatorni zahtjevi u nekim industrijama, poput lijekova, zahtijevaju vrlo visoku razinu čistoće za peptide koji se koriste u razvoju lijekova. Ako se peptid smatra potencijalnim terapijskim sredstvima, svaka nečistoća mogla bi predstavljati rizik za sigurnost pacijenata, pa su dodatni koraci pročišćavanja neophodni.
Kromatografske metode
Obrnuto - faza visoka - tekuća kromatografija performansi (RP - HPLC)
RP - HPLC jedna je od najčešće korištenih metoda za pročišćavanje peptida. Razdvaja peptide na temelju njihove hidrofobnosti. Stacionarna faza u RP - HPLC je hidrofobni materijal, obično stupac temeljen na silicijumu s priloženim alkilnim lancima (npr. C18 ili C8). Peptidi s različitim hidrofobičnostima različito će komunicirati s stacionarnom fazom, što će rezultirati različitim vremenima zadržavanja.
Da bismo dodatno pročišćavali kataloške peptide pomoću RP - HPLC, prvo moramo odabrati odgovarajuću mobilnu fazu. Uobičajena mobilna faza sastoji se od mješavine vode i organskog otapala poput acetonitrila ili metanola, s dodatkom male količine kiseline (npr. Trifluorooctene kiseline, TFA) za poboljšanje vršnog oblika. Podešavanjem gradijenta organskog otapala možemo optimizirati odvajanje ciljnog peptida od nečistoća.
Na primjer, ako imamo katalog peptida poputLL-37, antimikrobni peptid, koji je antimikrobni peptid s potencijalnim terapijskim primjenama, RP - HPLC može se koristiti za uklanjanje preostale sinteze putem proizvoda ili degradiranih fragmenata. Pročišćeni LL - 37 tada se može koristiti u preciznijim testovima antimikrobnih aktivnosti.
Ion - razmjena kromatografija
Ion - razmjena kromatografija razdvaja peptide na temelju njihovog naboja. Postoje dvije glavne vrste: Kromatografija kationa - Exchange (CEX) i anion - razmjena kromatografija (AEX). U CEX -u, stacionarna faza ima negativno nabijenu skupinu, a peptidi s neto pozitivnim nabojem vežu se na nju. U AEX -u je stacionarna faza pozitivno nabijena i zadržat će se negativno nabijeni peptidi.
Izbor između CEX -a i AEX -a ovisi o izoelektričnoj točki (PI) peptida. Ako je PI peptida ispod pH mobilne faze, peptid će imati neto negativni naboj i može se koristiti AEX. Suprotno tome, ako je PI iznad pH mobilne faze, CEX je prikladniji.
Na primjer,Ureistachykinin II, peptid sa specifičnim profilom naboja, može se dodatno pročistiti pomoću ionske kromatografije. Pažljivim odabirom pH i ionske snage mobilne faze možemo postići dobro odvajanje ciljanog peptida od ostalih nabijenih nečistoća.
Elektroforetske metode
Natrijev dodecil sulfat - elektroforeza poliakrilamidnog gel (SDS - STRA)
Iako se SDS - stranica uglavnom koristi za analizu proteina, ona se u određenoj mjeri može primijeniti i na pročišćavanje peptida. U SDS -u - PEPTIDI se denaturiraju SDS -om i razdvajaju se na temelju njihove molekularne mase. Peptidi migriraju kroz poliakrilamidni gel pod utjecajem električnog polja.
Nakon elektroforeze, gel se može obojiti za vizualizaciju peptida. Poveznica koja odgovara ciljanom peptidu tada se može izrezati iz gela, a peptid se može eluirati iz matrice gela. Međutim, ova metoda ima određena ograničenja. Proces elucije može biti složen, a tijekom pročišćavanja može biti gubitka peptida. Također, SDS može biti teško potpuno ukloniti iz pročišćenog peptida.
Kapilarna elektroforeza (CE)
Kapilarna elektroforeza snažna je tehnika razdvajanja za peptide. Nudi visoku učinkovitost odvajanja, kratko vrijeme analize i malu potrošnju uzorka. CE razdvaja peptide na temelju omjera naboja - do - mase. Postoje različiti načini CE, kao što su elektroforeza kapilarne zone (CZE), kapilarna elektroforeza (CGE) i micelarna elektrokinetička kromatografija (MEKC).
CZE je najčešće korišteni način rada za analizu i pročišćavanje peptida. U CZE -u se peptidi razdvajaju u kapilaru ispunjenom puferom ispod električnog polja. Razdvajanje se temelji na razlikama u elektroforetskoj pokretljivosti peptida. CE se može povezati s različitim metodama otkrivanja, poput UV apsorpcije, fluorescencije i masene spektrometrije, kako bi se poboljšala točnost identifikacije i pročišćavanja peptida.
Ostala razmatranja
Topljivost
Topljivost peptida važan je faktor u procesu pročišćavanja. Ako peptid ima slabu topljivost u otapalima za pročišćavanje, to može dovesti do oborina tijekom pročišćavanja, što će utjecati na oporavak i čistoću peptida. Da bismo poboljšali topljivost peptida, možemo prilagoditi pH otapala, dodati co -otapala ili koristiti specifične agense za solubilizaciju.
Analiza čistoće
Nakon daljnjeg pročišćavanja, ključno je analizirati čistoću peptida. Uobičajene metode za analizu čistoće uključuju tekuću kromatografiju visoke performanse (HPLC), masenu spektrometriju (MS) i nuklearnu magnetsku rezonancu (NMR). HPLC može pružiti informacije o kromatografskoj čistoći peptida, dok MS može potvrditi molekulsku masu peptida i otkriti bilo kakve nečistoće s različitim masama. NMR se može koristiti za određivanje strukture i čistoće peptida na atomskoj razini.
Zaključak
Kao dobavljač kataloga peptida posvećeni smo pružanju peptida visoke kvalitete našim kupcima. Kada je potrebno daljnje pročišćavanje kataloških peptida, na raspolaganju imamo različite metode, uključujući kromatografske metode, elektroforetske metode i druga razmatranja kao što su analiza topljivosti i čistoće. Pažljivim odabirom odgovarajuće metode pročišćavanja i optimiziranjem uvjeta pročišćavanja, možemo osigurati da peptidi ispunjavaju zahtjeve visoke čistoće naših kupaca.
Ako imate bilo kakve potrebe za kataloškim peptidima ili potrebne daljnje usluge pročišćavanja, slobodno nas kontaktirajte radi nabave i rasprave. Radujemo se što ćemo raditi s vama kako bismo udovoljili vašim potrebama za istraživanje i razvoj peptida.
Reference
- Snyder, LR, Kirkland, JJ, & Dolan, JW (2010). Uvod u modernu tekuću kromatografiju. Wiley.
- Jorgenson, JW, & Lukacs, KD (1981). Elektroforeza kapilarne zone. Analitička kemija, 53 (8), 1298 - 1302.
- Laemmli, Velika Britanija (1970). Raspajanje strukturnih proteina tijekom sastavljanja glave bakteriofaga T4. Priroda, 227 (5259), 680 - 685.