Hej tamo! Ja sam dobavljač TET - 213 stanica, a danas ću vas provesti kroz kako izvesti imunofluorescentno bojenje na tim stanicama. Imunofluorescentno bojenje je super korisna tehnika u svijetu stanične biologije. Pomaže nam da vizualiziramo specifične proteine unutar stanica, pružajući nam bolje razumijevanje njihovih funkcija i lokacija.
Priprema TET - 213 stanica
Prvo stvari, moramo pripremiti svoje TET - 213 stanice. Započnite uzgajanjem u odgovarajućem kulturi. Ove stanice obično se dobro snalaze u mediju poput RPMI 1640 dopunjene 10% fetalnim goveđim serumom (FBS) i 1% penicilin - streptomicin. Inkubirajte stanice na 37 ° C u 5% CO₂ atmosferi.
Jednom kada stanice dosegnu oko 70 - 80% konfluence, vrijeme je za pokretanje postupka bojenja. Morat ćete sjediti stanice na poklopce na ploči od 24 dobrog. To olakšava rukovanje ćelijama tijekom koraka bojenja. Pomoću pipete pažljivo prebacite suspenziju ćelije na poklopce. Obavezno ravnomjerno raspodijelite stanice.
Fiksiranje ćelija
Nakon što su se stanice pričvrstile na poklopce (obično nakon 24 sata), vrijeme je da ih popravite. Fiksacija je presudna jer čuva staničnu strukturu i drži proteine na mjestu. Možete upotrijebiti fiksativ poput 4% paraformaldehida (PFA) u fiziološkoj otopini (PBS) puferiranom fosfatom. Dodajte dovoljno PFA da prekrivate stanice na poklopcima i ostavite da sjedi na sobnoj temperaturi oko 15 - 20 minuta.
Nakon što fiksacija bude gotova, stanice tri puta operite s PBS -om. Svako pranje trebalo bi trajati oko 5 minuta. To pomaže u uklanjanju viška fiksacija iz stanica.
Permeabilizacija
Sljedeće je permeabilizacija. Ovaj korak omogućuje antitijelima da uđu u stanice i vežu se na ciljne proteine. Upotrijebite permeabilizacijsko sredstvo poput 0,1% Triton x - 100 u PBS -u. Dodajte otopinu permeabilizacije u stanice i ostavite da se inkubira na sobnoj temperaturi oko 10 minuta.
Nakon toga, stanice ponovo operite tri puta s PBS -om, baš kao i u prethodnom koraku. To osigurava da se permeabilizing sredstvo u potpunosti ukloni.
Blokiranje
Blokiranje je važan korak za sprečavanje ne -specifičnog vezanja antitijela. U PBS -u možete koristiti rješenje za blokiranje poput 5% goveđeg serumskog albumina (BSA). Dodajte otopinu blokiranja stanicama i ostavite da se inkubira na sobnoj temperaturi oko 1 sat.
Primarna inkubacija antitijela
Sada je vrijeme za dodavanje primarnog antitijela. Primarno antitijelo specifično je za protein koji želite otkriti u stanicama Tet - 213. Razrijedite primarno antitijelo u rješenju za blokiranje prema uputama proizvođača.
Pažljivo uklonite otopinu blokiranja iz stanica i dodajte razrijeđeno primarno antitijelo. Obavezno prekrijte stanice u potpunosti otopinom antitijela. Inkubirajte stanice s primarnim antitijelom preko noći na 4 ° C. Ovo dugo vrijeme inkubacije omogućava da se antitijelo učinkovito veže za ciljni protein.
Sljedeći dan stanice tri puta operite s PBS -om, pri čemu je svako pranje trajalo oko 5 minuta. To se riješi bilo kojeg nevezanog primarnog antitijela.
Sekundarna inkubacija antitijela
Nakon primarne inkubacije antitijela, vrijeme je za sekundarno antitijelo. Sekundarno antitijelo označeno je fluorescentnim bojama, što nam omogućava vizualizaciju ciljanog proteina pod fluorescentnim mikroskopom.
Razrijedite sekundarno antitijelo u blokirajućoj otopini prema uputama proizvođača. Uklonite PBS iz stanica i dodajte razrijeđeno sekundarno antitijelo. Inkubirajte stanice na sobnoj temperaturi oko 1 - 2 sata u mraku. Tamno okruženje je važno kako bi se spriječilo da fluorescentna boja blijedi.
Nakon što je inkubacija završena, stanice tri puta operite s PBS -om, baš kao i prije.
Suprotstavljanje
Promjena se koristi za vizualizaciju staničnih jezgara. Možete koristiti boju poput DAPI (4 ', 6 - Diamidino - 2 - fenilindol). Razrijedite DAPI u PBS -u i dodajte ga stanicama. Ostavite da se inkubira na sobnoj temperaturi oko 5 minuta.
Nakon toga još jednom operite stanice PBS -om kako biste uklonili višak DAPI.
Montaža
Konačno, vrijeme je da se poklopci montiraju na dijapozitive mikroskopa. Koristite montažni medij, koji pomaže u održavanju stanica na mjestu i također čuva fluorescenciju. Pažljivo stavite kap za ugradnju na klizač mikroskopa, a zatim preokrenuti poklopac na kap. Pazite da nema mjehurića zraka zarobljenih između pokrivača i slajda.
Slikanje
Sada ste spremni slikati stanice pod fluorescentnim mikroskopom. Pomoću odgovarajućih filtera vizualizirajte fluorescentne signale iz sekundarnog antitijela i DAPI. Više slika možete snimiti na različitim poljima vida kako biste dobili dobar prikaz stanica.
Korištenje povezanih peptida u procesu
Tijekom procesa stanične kulture i bojenja, možda ćete naći i neke peptide korisne. Na primjer,(Gly14) -humanin (čovjek)Pokazalo se da imaju neke korisne učinke na vitalnost i funkciju stanica. Možete ga dodati u kulturni medij da biste vidjeli utječe li na ekspresiju proteina koju proučavate u stanicama Tet - 213.
Fibronektin cs1 peptidmože se koristiti za premazanje pokrivača prije nego što se stanice zasijaju. To može poboljšati pričvršćivanje i širenje stanica, što postupak bojenja čini učinkovitijim.
Endotelin - 1 (11 - 21)također može igrati ulogu u signalnim putovima unutar stanica Tet - 213. Možete ga dodati u kulturni medij, a zatim proučiti kako on utječe na ekspresiju ciljanog proteina imunofluorescentnim bojenjem.
Zaključak
Izvođenje imunofluorescentnog bojenja na TET - 213 stanica može biti pomalo škakljiv proces, ali ako pažljivo slijedite ove korake, trebali biste biti u mogućnosti dobiti neke sjajne rezultate. To je moćna tehnika koja vam može dati vrijedan uvid u biologiju ovih stanica.
Ako ste zainteresirani za kupnju TET - 213 ćelija ili bilo kojeg od povezanih peptida spomenutih na ovom blogu, slobodno nam se obratite za više informacija i započeti raspravu o nabavi. Tu smo da vam pomognemo u svim vašim potrebama za biologijom stanica.
Reference
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2002). Molekularna biologija stanice. Garland Science.
- Pollard, TD, & Earnshaw, WC (2004). Stanična biologija. Saunders.