Systemin je dobro poznati biljni peptidni hormon koji igra ključnu ulogu u obrambenom odgovoru biljke protiv biljojeda i patogena. Kao vodeći dobavljač Systemina, razumijevanje kako detektirati Systemin u biljkama od iznimne je važnosti, ne samo za znanstvena istraživanja već i za osiguravanje kvalitete i autentičnosti proizvoda Systemin koje nudimo. U ovom ćemo blogu istražiti različite metode otkrivanja Systemina u biljkama, zalazeći u znanstvene principe iza svakog pristupa.
1. Imunološke metode detekcije
Imunološke tehnike detekcije naširoko se koriste za detekciju Systemina u biljkama zbog njihove visoke specifičnosti i osjetljivosti. Ove se metode oslanjaju na upotrebu protutijela koja specifično prepoznaju i vežu se na Systemin.
Enzimski imunološki test (ELISA)
ELISA je često korištena imunološka metoda. Uključuje oblaganje mikropločice antitijelom specifičnim za Systemin. Zatim se u jažice mikropločice dodaju biljni ekstrakti. Ako je Systemin prisutan u ekstraktu, on će se vezati na imobilizirano antitijelo. Nakon toga se dodaje drugo antitijelo konjugirano s enzimom. Ovo sekundarno protutijelo također se veže za Systemin. Nakon ispiranja nevezanih tvari dodaje se supstrat za enzim. Reakcija enzim - supstrat proizvodi signal koji se može detektirati, često promjenu boje, koja se može izmjeriti fotometrijski. Intenzitet signala proporcionalan je količini Systemina u uzorku.
Prednosti ELISA testa uključuju njegovu visoku osjetljivost, mogućnost obrade više uzoraka istovremeno i relativnu jednostavnost korištenja. Međutim, zahtijeva proizvodnju visokokvalitetnih antitijela, a križna reaktivnost s drugim peptidima u biljnom ekstraktu ponekad može biti problem.
Western Blotting
Western blotting još je jedna moćna imunološka tehnika. Prvo se biljni proteini ekstrahiraju i odvajaju gel elektroforezom na temelju njihove molekularne težine. Odvojeni proteini se zatim prenose na membranu. Antitijelo specifično za Systemin inkubira se s membranom. Nakon ispiranja dodaje se sekundarno protutijelo konjugirano s detekcijskim reagensom (kao što je fluorescentni ili kemiluminiscentni marker). Prisutnost Systemina vizualizira se kao posebna traka na membrani.
Western blotting omogućuje određivanje molekularne težine Systemina i može pružiti informacije o njegovim mogućim modifikacijama. Međutim, oduzima više vremena i tehnički je zahtjevniji u usporedbi s ELISA-om.
2. Masena spektrometrija - detekcija temeljena
Masena spektrometrija (MS) vrlo je precizna i svestrana metoda za otkrivanje Systemina u biljkama. Može identificirati i kvantificirati peptide na temelju njihovog omjera mase i naboja (m/z).
Tekuća kromatografija - spektrometrija mase (LC - MS)
U LC - MS, biljni ekstrakti se prvo odvajaju tekućinskom kromatografijom. Odvojene komponente se zatim uvode u maseni spektrometar. Maseni spektrometar ionizira molekule i mjeri njihove m/z vrijednosti. Usporedbom dobivenih m/z vrijednosti s teorijskim m/z Systemina može se potvrditi prisutnost Systemina.
LC - MS nudi visoku razlučivost i mogućnost otkrivanja Systemina čak iu složenim biljnim matricama. Također može pružiti informacije o strukturi i mogućim posttranslacijskim izmjenama Systemina. Međutim, zahtijeva skupu opremu i visoko obučeno osoblje.
Tandemska spektrometrija mase (MS/MS)
MS/MS je proširenje masene spektrometrije. Nakon početne analize mase u prvom spektrometru mase, odabrani ioni se fragmentiraju, a fragmenti se analiziraju u drugom spektrometru mase. To omogućuje određivanje sekvence aminokiselina Systemina, što je bitno za potvrdu njegovog identiteta.
MS/MS je posebno koristan kada se radi s uzorcima u kojima bi mogli postojati izobarni ili izomerni peptidi koji bi mogli ometati identifikaciju. Pruža detaljne strukturne informacije o Systeminu, ali je također složeniji i dugotrajniji od jednostupanjske masene spektrometrije.
3. Molekularna biologija - detekcija na temelju
Tehnike molekularne biologije također se mogu koristiti za otkrivanje Systemina na razini ekspresije gena.
Reverzna transkripcija - lančana reakcija polimerazom (RT - PCR)
RT - PCR se koristi za detekciju mRNA koja kodira Systemin. Prvo, ukupna RNK se ekstrahira iz biljnog tkiva. Zatim se mRNA reverzno prepisuje u komplementarnu DNK (cDNK) pomoću reverzne transkriptaze. Za umnožavanje cDNA pomoću PCR-a koriste se specifični primeri za Systemin gen. Umnoženi fragmenti DNA mogu se vizualizirati elektroforezom u gelu.
RT - PCR omogućuje otkrivanje ekspresije Systemin gena, što može ukazati na fiziološko stanje biljke u smislu njezinog obrambenog odgovora. Međutim, pruža samo informacije o potencijalnoj proizvodnji Systemina na transkripcijskoj razini i ne mjeri izravno prisutnost samog peptida.
Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu (qRT - PCR)
qRT - PCR je naprednija verzija RT - PCR-a. Omogućuje kvantifikaciju količine Systemin mRNA u uzorku. Tijekom PCR reakcije koristi se fluorescentna boja ili fluorescentno obilježena sonda za praćenje pojačanja u stvarnom vremenu. Ciklus u kojem fluorescentni signal prelazi prag (vrijednost Ct) obrnuto je proporcionalan količini ciljne mRNA.
qRT - PCR pruža točniju kvantifikaciju ekspresije Systemin gena u usporedbi s tradicionalnom RT - PCR. Korisno je za proučavanje regulacije proizvodnje Systemina kao odgovora na različite podražaje.
4. Biotest - Detekcija na temelju
Biotestovi se oslanjaju na biološku aktivnost Systemina za otkrivanje njegove prisutnosti. Na primjer, poznato je da Systemin inducira sintezu inhibitora proteaze u biljkama. Biotest se može postaviti tretiranjem biljnog tkiva uzorkom za koji se sumnja da sadrži Systemin i zatim mjerenjem indukcije inhibitora proteaze.
Prednost bioloških testova je u tome što izravno mjere biološku aktivnost Systemina. Međutim, one su manje specifične u usporedbi s drugim metodama i na njih mogu utjecati drugi čimbenici u biljnom ekstraktu koji također mogu utjecati na sintezu inhibitora proteaze.
Zaključak
Kao Systemin dobavljač, razumijemo važnost točne i pouzdane Systemin detekcije. Svaka od gore opisanih metoda ima svoje prednosti i ograničenja. Imunološke metode su vrlo specifične i osjetljive, masena spektrometrija pruža detaljne strukturne informacije, tehnike molekularne biologije nude uvid u ekspresiju gena, a biološki testovi mjere biološku aktivnost. U praksi se može koristiti kombinacija ovih metoda kako bi se osigurala točna detekcija i kvantifikacija Systemina u biljkama.
Ako ste zainteresirani za kupnju visokokvalitetnog Systemina za vaše istraživanje ili druge primjene, pozivamo vas da nas kontaktirate radi daljnjih razgovora. Posvećeni smo pružanju najboljih proizvoda i usluga. Možda će vas također zanimati neki od naših drugih peptidnih proizvoda, kao što suFragment glikoproteina IIb (296 - 306),PHM - 27 (ljudski), iSekretin (štakor).
Reference
- Ryan, CA (2000). Sustav u signalnom putu: diferencijalna aktivacija biljnih obrambenih gena. Biochimie, 82 (10 - 11), 847 - 853.
- Schilmiller, AL i Howe, GA (2005). Systemin: polipeptidni signal za obrambene reakcije biljaka. Current Biology, 15(18), R744 - R747.
- van der Hoorn, RA, i Jones, JD (2004). Proteaze u obrani od patogena. Current Opinion in Plant Biology, 7(4), 400 - 406.